2.1前言

2.1.1馬兜鈴酸性質(zhì)

馬兜鈴酸是一大類硝基菲類有機(jī)酸化合物，包括馬兜鈴酸 A、B、C、D以及馬兜鈴內(nèi)酞胺等等。存在于馬兜鈴屬及細(xì)辛屬等馬兜鈴科植物中，而這些植物曾廣泛地被中醫(yī)作為原生藥材入藥，依靠吸食這類植物生存的蝴蝶體內(nèi)也有馬兜鈴酸。

2.1.2馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)

圖2-1  馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)式

2.1.3馬兜鈴酸危害

     馬兜鈴酸類化合物中，主要的毒性成分為馬兜鈴酸A或其代謝物馬兜鈴內(nèi)酞胺，硝基是馬兜鈴酸類衍生物中最主要的毒性基團(tuán)，此外甲氧基和羥基的存在可以使馬兜鈴酸的毒性進(jìn)一步加強(qiáng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，不但馬兜鈴酸具有很強(qiáng)的腎毒性，其代謝產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺同樣具有腎毒性。又通過(guò)對(duì)馬兜鈴酸代謝過(guò)程及代謝酶的研究證實(shí)，馬兜鈴酸可使RAS基因和P53基因發(fā)生突變，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。因此需要對(duì)馬兜鈴酸進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.4檢測(cè)方法

     大連依利特分析儀器有限公司結(jié)合GB/T 35949-2018《化妝品中禁用物質(zhì)米馬兜鈴酸A的測(cè)定高效液相色譜法》提出了針對(duì)膏霜、乳液、化妝水等皮膚護(hù)理類化妝品中馬兜鈴酸A分析的全套解決方案。相關(guān)人員可參考本實(shí)驗(yàn)中的方法，進(jìn)行化妝品中馬兜鈴酸A的測(cè)定。

表2-1(a)  EClassical 3100型高效液相色譜系統(tǒng)設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)配置清單

表2-1(b)  iChrom 5100型高效液相色譜系統(tǒng)設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)配置清單

注：或同等配置的其他型號(hào)的高效液相色譜儀

表2-2 主要化學(xué)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2-3  主要樣品前處理設(shè)備

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其它玻璃器皿還包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL)、移液槍(0～1000µL，0～5000µL)、移液槍槍頭(1mL，5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、進(jìn)樣針、濾膜等若干。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100μg/mL)：取馬兜鈴酸標(biāo)準(zhǔn)品約5mg置于50mL容量瓶中，用甲醇定容。

     馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動(dòng)相配制濃度分別為1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3.2樣品前處理

     稱取化妝品約1.0g（精確至0.0001g），置于50mL離心管中，精密加入甲醇10mL，超聲提取20min，5000r/min離心15min后，上清液經(jīng)0.45µm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.3.3色譜條件

     流動(dòng)相：甲醇:0.5%冰醋酸水溶液=70:30(V:V)

     色譜柱：Supersil ODS2 5μm 4.6×200mm

     流速：1.0mL/min

     檢測(cè)波長(zhǎng)：315nm

     進(jìn)樣量：20µL

     柱溫：30℃

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1.典型分離色譜圖

進(jìn)樣分析濃度為20μg/mL的馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)工作液，使用2.3.3中的色譜條件，結(jié)果如下圖所示。

圖2-4  馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

表2-4  色譜參數(shù)

從以上結(jié)果可知，馬兜鈴酸A分析速度快，不對(duì)稱度好，柱效高，故該方法適合于馬兜鈴酸A的分析。

將馬兜鈴酸A標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按2.3.3中色譜條件進(jìn)行分析，馬兜鈴酸的線性方程及檢出限如下表所示。

表2-5  線性方程

從上表可知，馬兜鈴酸A濃度在1.0μg/mL到50μg/mL線性范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)大于0.999。

以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度換算為儀器的檢出限，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為儀器的定量限，結(jié)果如下表所示。

表2-6  檢出限對(duì)比

從以上結(jié)果可知，本系統(tǒng)的馬兜鈴酸A檢測(cè)的靈敏度明符合國(guó)標(biāo)中的要求，即符合檢測(cè)要求。

2.4.3.方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性

在添加濃度5.0μg/mL~20.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)，測(cè)得回收率82.3%～90.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～2.9%。

表2-7  化妝品中馬兜鈴酸A方法準(zhǔn)確性與重復(fù)性結(jié)果

2.4.4.實(shí)際樣品

市場(chǎng)購(gòu)化妝品，按本文中提到的方法進(jìn)行了分析，結(jié)果如下所示。

圖2-5  實(shí)際樣品譜圖

表2-7  實(shí)際樣品

2.5參考文獻(xiàn)

[1]GB/T 35949-2018《化妝品中禁用物質(zhì)米馬兜鈴酸A的測(cè)定高效液相色譜法》。